بررسی بیش بیان ژن pax6(5a) انسانی در سلول های بنیادی مزانشیمی استحصال شده از بافت چربی انسانی و بررسی چگونگی تمایز آنها به سلول های عصبی شبکیه در شرایط in vitro

مقدمه: یکی از اجزای اصلی و بسیار مهم در چشم لایه شبکیه می باشد. در طی زندگی، شبکیه در معرض ناهنجاری های متفاوتی مانند تخریب وابسته به سن ماکولا، گلوکوما و رتینیتیس پیگمنتوزا قرار می گیرد. در سال های اخیر توجه محققان به استفاده از روش های سلول درمانی معطوف گشته که در آنها باززایی سلول های اپی تلیوم رنگدانه دار شبکیه (rpe) و سلول های گیرنده نوری از یک منبع سلولی مناسب انجام می شود. یکی از موضوعات بسیار مهم در سلول درمانی، دست یابی به سلول های تمایز یافته می باشد. تاکنون منابع سلولی متعددی جهت استفاده در سلول درمانی مورد مطالعه قرار گرفته اند. سلول های بنیادی مزانشیمی بدست آمده از بافت چربی (adscs) دارای ویژگی های مثبت زیادی می باشند و می توانند به عنوان یک کاندید مناسب در سلول درمانی مورد توجه قرار گیرند. ژن pax6(5a) در میان جانوران، حفاظت شده بوده و نقش بسیار مهمی در تشکیل شبکیه چشم دارد، بنابراین می تواند برای تمایز هدف دار سلول های بنیادی از منابع مختلف مورد استفاده قرار بگیرد. هدف از انجام این مطالعه همسانه سازی ژن pax6(5a) در ناقل لنتی ویروسی، آلوده سازی hadscs و بررسی بیش بیان این فاکتور رونویسی در تمایز hadscs به سمت سلول های مختلف تشکیل دهنده شبکیه بود. مواد و روش ها: در این تحقیق چربی انسانی از بافت های چربی زیر پوستی شکمی افرادی که عمل جراحی abdominoplasty داشتند تهیه گردید. سلول های بنیادی مزانشیمی بافت چربی تخلیص و کشت شدند. سلول های بدست آمده از لحاظ نشانگرهای سطحی و هم چنین قدرت تمایز انها به سمت سلول های چربی و استخوان مورد بررسی قرار گرفتند. در مرحله بعد توالی کد کننده ژن pax6(5a) سنتز شده و در ناقل بیانی لنتی ویروسی plex- mcs- pur همسانه سازی گردید. سازه نوترکیب توسط روش های pcr، هضم آنزیمی و در نهایت توالی یابی تایید شد. ذرات لنتی ویروس در سلول های hek293t تولید شدند و سپس hadscs توسط ذرات ویروسی آلوده گردیدند. سلول های آلوده شده توسط مقاومت به آنتی بیوتیک پیورومایسین انتخاب گردیدند. سلول های آلوده شده بعد از 6 روز توسط روش های icc و real time pcr برای بررسی تعدادی از نشانگرهای سلول های شبکیه مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج: hadscs با خلوص بالایی تخلیص و کشت شدند. سلول های تخلیص شده با موفقیت به سلول های چربی و استخوان تمایز یافته و فلوسایتومتری بیان نشانگرهای مربوطه را در این سلول ها تایید نمود. همسانه سازی ژن pax6(5a) در ناقل لنتی ویروسی توسط روش های مولکولی تایید گردید. ذرات ویروسی در سلول های hek293t تهیه و hadscs توسط آنها آلوده شدند. بررسی سلول های آلوده شده توسط روش های ایمنوسیتوشیمی و real time pcr، بیان نشانگرهای مورد قبول مربوط به سلول های گیرنده نوری مانند رودوپسین، crx، recoverin و pdc و همچنین نشانگرهای مورد قبول برای سلول های rpe مانند rpe65 و cralbp را تایید نمودند. نتیجه گیری: بیش بیان فاکتور رونویسیpax6(5a) موجب تمایز hadscs به سمت سلول های گیرنده نوری و rpe در شبکیه گردید. اما مطالعات بیشتری به خصوص در رابطه با قابلیت عملکرد و قدرت بقاء این سلول ها در محیط in vivo ضروری می باشد.